【论文摘要】目的探讨脂多糖(LPS)对体外培养人甲状腺细胞一氧化氮(NO)的诱生作用及对细胞膜上钠／碘转运体(NIS)基因表达的影响。方法采用细胞培养方法及半定量逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)技术，观察不同浓度LPS对甲状腺细胞NO的诱生作用及对NIS mRNA表达的影响。结果(1)LPS(1、10、100¨g／mL)剂量依赖性刺激体外培养人甲状腺细胞产生NO和抑制NIS的表达。结论LPs可抑制甲状腺细胞膜上NIS的基因表达，可能与LPS诱生甲状腺细胞产生NO有关。
【关键词】脂多糖；一氧化氮；钠／碘转运体
甲状腺疾病是多因素作用的结果，其中感染可以诱发甲状腺疾病已被公认，但其具体机制尚未清楚。NO是甲状腺组织及细胞内重要的信息分子，参与一系列甲状腺生理及病理过程心。1。NIS的主要作用是介导胞外碘进入甲状腺细胞，是甲状腺激素合成的基础，NIS与甲状腺疾病有着密切的关系。本文采用细胞培养方法及RT—PCR技术研究LPS对人甲状腺细胞NO的诱生作用及对其细胞膜上NIS基因表达的影响，为感染导致甲状腺疾病的发病机制提供理论依据。1资料与方法1．1 甲状腺组织取材与实验分组甲状腺腺瘤旁正常甲状腺组织由辽宁医学院附属第一医院手术室提供。根据LPS不同浓度分为1组(0彬mL)、2组(1 p．g／mL)、3组(10斗g／mL)、4组(100 ws／mL)。l．2 甲状腺细胞培养剥离甲状腺腺瘤旁正常甲状腺组织，以无钙镁Hank液洗2—3次，剪碎。0．25％胰酶和0．03％胶原酶消化60 min，1 200 r／min离心lOmin，将离心后的沉淀物制成细胞悬液并悬于含15％胎牛血清和l U／L促甲状腺素(TSH)的F一12培养液中。台盼蓝染色证明活细胞>95％后，调整细胞数(5 X 105)接种于培养瓶，37。C，CO，孵箱中培养，48 h换液。1．3鹏试验甲状腺原代细胞孵育5 d后，待细胞铺满培养瓶底(面积约26 cm2)，吸去营养液并换以含有不同浓度(0、l、10、100斗g／mL)LPS和LPS+L一精氨酸甲酯(L—NAME)(1 mmoL／L)的培养基分别孵育。1．4 NO测定硝酸还原酶法，按试剂盒说明操作，550 n／1]处测吸光度值。1．5 NIS mRNA检测采用半定量RT—PCR法检测。细胞继续培养48 h后，Trizol试剂提取总RNA。以逆转录酶(M—MLV)进行逆转录，PCR引物NIS：顺5’一CTCCCTGCTAACGACTCCAG一3’，反5’一AACA—GACGATCCTCATTGG’I’G一3’，B— actin：顺5’一TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA一3’．反5’一cTAGAAGCArIfI’GcGGTGGACGATGGAGGG一3’，扩增片段长度分别为392 bp和661 bp。PCR的条件为97℃5 min，93℃3 min预变性，93℃45 8，55℃45 s，72℃45 s，30个循环，72℃7 rain末循环。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶(含溴乙锭)进行电泳，以100 bpladder DNA为标志物，结果用K0dak Digital 1D ImageAnalysis Software(Eastman Kodak Company)成像系统扫描，测定光密度值并计算NIS／13一actin光密度比值。1．6试剂与仪器LPS、牛TSH、L—NAME、F一12培养基：Sigma公司；％z01试剂：GibeoBRL公司；M—IVILV：Promega公司；NO检测试剂盒：南京建成生物公司；UVl601紫外分光光度仪：El本岛津公司。1．7统计学方法采用t检验和单因素方差分析。2结果LPS剂量依赖性抑制NIS的基因表达。L—NANE可阻止LPS对NIS基因表达的抑制；LPS剂量依赖性诱导甲状腺细胞产生NO，L—NAME对此作用产生明显抑制，见表l。3讨论目前，大量的人体和动物研究表明，自身免疫性甲状腺疾病通常在遗传的基础上，因感染、精神创伤等应激因素而诱发，属于抑制性T淋巴细胞功能缺陷所导致的一种器官特异性自身免疫性疾病∞·。各种应激情况会使甲状腺激素的分泌、代谢出现紊乱，从而导致各种甲状腺疾病¨1。NIS是甲状腺激素合成的基础，受到很多因素的调控。一些细胞因子导致甲状腺疾病就是通过抑制NIS表达实现的伸1。自上世纪80年代内源性NO被发现以来，其广泛而重要的生理及病理作用已越来越引起人们的重视。NO这一人们已熟悉的无机小分子物质主要是通过L一精氨酸一NO途径在一氧化氮合酶(NOS)的作用下合成NO。现被研究证实：NO和NOS的异常与甲状腺疾病有密切关系。NO作用依赖于NO生成量，pmol／L或fmol／L水平NO参与信息传递等生理作用，nmol／L水平NO则引起细胞毒等病理作用一1。本实验LPS剂量依赖性诱导甲状腺细胞产生NO，并且诱生量达I山mol／L。这样可能对甲状腺细胞有病理作用。L—NAME竞争性抑制NOS，本实验L—NAME明显抑制NO生成，说明诱生的NO由NOS合成。LPS可促进其他细胞NOS的表达¨⋯，是否能上调甲状腺细胞NOS表达仍需进一步研究。本实验显示LPS剂量依赖性抑制人甲状腺细胞NIS的基因表达而L—NAME可阻止上述作用，提示LPS抑制NIS的表达可能有NO参与，而这与之前研究NO能抑制甲状腺细胞碘摄取的结果相符旧1，NO能否能抑制NIS的表达正在实验中。总之，LPS作为细菌感染宿主的主要物质可能参与一些甲状腺疾病的发病过程。NO是一类甲状腺生物调节剂，它在甲状腺调节网络中占有重要的地位。深人研究LPS、NO和甲状腺之间的内在联系将有助于提高对感染致甲状腺疾病发病机制的进一步了解。
发表评论:
