【论文摘要】 目的优选出分离纯化黄芪中黄芪总皂苷的最佳工艺条件。 方法采用动态吸附解析法,用超高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量,优选出最佳纯化条件。 结果D101树脂对黄芪总皂苷的纯化最优,以2 BV/h吸附速率吸附,5 BV 70%乙醇以3 BV/h的流速进行洗脱效果最佳,黄芪甲苷的精制度为446.28%。 结论D101大孔吸附树脂可用于黄芪总皂苷的纯化。
　　 【关键词】黄芪;黄芪总皂苷;大孔树脂
　　

　　
　　 黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根^[1],其主要成分为黄芪总皂苷,具有广泛的药理作用,如强心、抗胃溃疡、对外周神经系统的再生具有双重调节作用、降血压等作用^[2-5]。本文以黄芪甲苷为指标对黄芪中黄芪总皂苷的纯化进行了研究,为以后黄芪的进一步开发做基础。 
　　1 材料与仪器
　　黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110781200613);黄芪药材(浙江中医药大学中药饮片厂),经浙江中医药大学资源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定为膜荚黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。化学试剂均为分析纯。D201、D101、DM130(天津南开大学化工厂)。赛多利斯分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司);RE52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),Waters Acquity^TMUltraperformance LC色谱仪、Acquity^TMTUV检测器;
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C₁₈(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相:乙腈-水(35∶65); 漂移温度:50℃;流速:02 ml/min;柱温:30℃;氮气压力:45PSI。
　　2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量,用甲醇制成浓度为0066 mg/ml的溶液,作为对照品溶液。
　　2.3 供试品溶液的制备 取黄芪粗粉约3 g,精密称定,加甲醇24 ml加热回流2次,每次2 h,过滤合并滤液,减压回收并用甲醇定容至50 ml量瓶中,备用。
　　2.4 标准曲线的制备 取“2.2”项下的对照品溶液,分别进样05、1、1.5、2.0、2.5 μl,以对照品峰面积的常用对数值(Y)为纵坐标、进样量(μg)的常用对数值(X)为横坐标进行线性回归,得回归方程为Y=39921X16698( r =09997)。结果表明,黄芪甲苷进样量在0033~0165 μg范围内的对数值与峰面积对数值呈良好线性关系。
　　2.5 精密度实验 取2.2项下的对照品溶液进样,重复测定6次,每次进样3 μl,记录峰面积,计算得RSD为051%。
　　2.6 稳定性实验 按照“2.3”项下制备样品一份,分别于0 h、4 h、6 h、8 h、10 h进样,每次进样3 μl,依法测定,记录峰面积。计算得RSD为3.14%,表明样品在10 h内稳定。
　　3 上柱药液的制备
　　取黄芪粗粉约80 g,精密称定,加甲醇240 ml加热回流2次,每次2 h,过滤,合并滤液,减压回收甲醇并用纯净水定容至50 ml量瓶中,备用。
　　4 树脂的选择
　　称取预处理过的树脂各5 g于100 ml锥形瓶中,加入一定量供试品溶液,盖紧瓶塞,每隔10 min振摇20 s,持续2 h,静止放置24 h,过滤,测量滤液中黄芪甲苷含量,计算吸附率。将经静态吸附后的树脂水洗至无Molish反应(吸取1 ml清洗液,加5%α萘酚乙醇溶液3滴,摇匀。沿试管壁缓缓加入05 ml浓硫酸,如在试管与硫酸的交界面处,很快形成紫色环),加70%乙醇20 ml解吸,每隔10 min振摇20 s,持续2 h,静置24 h后,过滤得解析液,测定其黄芪甲苷含量,计算解析率。
　　 表1
　　 树脂的筛选
　　树脂型号 吸附率(%) 转移率(%)
　　D201 705 62.9
　　D101 92.8 89.2
　　DM130 88.3 84.8
　　表1表明,D101对柴胡皂苷和姜黄素的吸附率与转移率均最高,所以选用D101大孔树脂。
　　5 动态考察
　　5.1 动态吸附曲线的考察 取DM101树脂20 g(ф18 mm×40 cm)于柱内,精密吸取按上述方法制备的黄芪水溶液上柱,流速为3 BV/h,每20 ml收集为一流分,测量流出液中黄芪甲苷的含量。以流出液体积(ml)为横坐标,黄芪甲苷的量(mg)为纵坐标,分别绘制泄漏曲线,计算树脂吸附容量。树脂吸附量=泄漏点上样体积(ml)×样品浓度(mg/ml)
　　 图1 动态泄露曲线
　　由图1可知,D101树脂的吸附饱和点为120 ml,即每克D101可吸附黄芪甲苷1.25 mg。
　　5.2 上柱药液浓度的考察 取D101树脂10 g,将上述样品(黄芪甲苷浓度为08 mg/ml)分别加水稀释成浓度为04、02、01 mg/ml的上样液,以2 BV/h的流速进行吸附,水洗,70%乙醇以3 BV/h的流速洗脱,收集洗脱液,测定黄芪甲苷的含量。
图2 不同药液浓度对黄芪甲苷纯化的影响
　　 由图2可以得出当含黄芪甲苷为08 mg/ml时,吸附率最高,当浓度更高时容易使柱子堵塞,故确定药液浓度为08 mg/ml。 
　　5.3 吸附流速的考察 取最佳浓度下的黄芪水溶液,控制流速1、2、3、4、5 BV/h进行吸附,水洗,以3 BV/h的70%乙醇5 BV洗脱。收集上样残留液和醇洗脱液,分别测定其黄芪甲苷的含量。
　　 图3 不同吸附流速对黄芪甲苷纯化的影响
　　由图3可得出,当吸附流速为2BV/h时吸附率最大
　　5.4 乙醇洗脱浓度的考察 分别取5根树脂柱各以2BV/h的吸附流速上药液。用纯净水洗后,分别用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇(分别标为15号)各5 BV,以3 BV/h流速依次进行洗脱,分别收集不同浓度的乙醇洗脱液5份。测定含量。
　　 图4 不同乙醇浓度对黄芪甲苷纯化的影响
　　由图4可得,4号浓度的乙醇对柴胡甲苷纯化最佳,故选择70%的乙醇洗脱。
　　5.5 洗脱流速的考察 按上述所确定的条件进行吸附,洗脱,控制5 BV 70%的乙醇分别以1、2、3、4、5 BV/h洗脱,收集洗脱液,计算柴胡皂苷和姜黄素的含量。
　　 图5 不同洗脱流速对黄芪甲苷纯化的影响
　　由图5可得,洗脱流速为1 BV/h和3 BV/h时黄芪甲苷的解析率相当,为提高工作效率选用3 BV/h的流速。
　　6 重复验证试验
　　根据上述试验结果,按最佳条件,即取浓度为08 mg/ml的黄芪水溶液以2 BV/h上样,水洗至无Molish反应,5 BV 70%乙醇洗脱,收集洗脱液,平行3份。测定黄芪甲苷的含量,另取黄芪上样品液及70%乙醇洗脱液水浴挥干,干燥至恒重,计算总固物。结果黄芪提取液纯化前黄芪甲苷量占总固物的4.97%,纯化后黄芪甲苷占总固物的22.18%,黄芪甲苷的精制度为446.28%。
　　7 讨论
　　本实验考察了70%乙醇洗脱用量对黄芪甲苷纯化的影响,随着乙醇用量的增加,黄芪甲苷的洗脱量增加,当洗脱用量达到5 BV时,洗脱量达到了总洗脱量的88.07%,若增加洗脱量则黄芪甲苷含量甚少,且加大了工作量,影响效率,故采用了5BV的用量。
　　用D101大孔树脂富集纯化黄芪总皂苷的效果好,采用5BV70%乙醇洗脱,洗脱率高,成本低,转移率达到71.17%,适于大工业化生产。
 

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